科研費（文科省・学振）獲得実績 - 臼井 健二
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マイクロ波による非平衡局所加熱現象を利用した位置選択的なペプチドの変換反応の開発
2024年4月 - 2027年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
担当区分：研究分担者
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難水溶性物質の皮膚感作性を評価するペプチド結合試験法の開発
2021年4月 - 2024年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
有海 秀人, 臼井 健二, 浜田 芳男
本研究の目的は、親水・疎水両溶媒になじむレジン樹脂に固定化したペプチドを用いることで、難水溶性物質のペプチド結合性試験を可能とし、被険物質と結合していないリジンのNH2残基に対してピクリン酸の指示薬を、システインのSH基に対してエルマン試薬の指示薬を組み合わせることで、分光法で検出が可能な極めて簡便な試験法の開発を目指すことである。
【2021年4月～2022年3月】高純度ペプチドビーズを用いた精油成分の皮膚感作性試験の実施
精油成分の被険物質（チモール、カルバクロール、オイゲノール）や陽性対照物質（ベンゾキノン）、陰性対照物質（イソプロパノール）を用いて、Lysペプチドを含む樹脂(0.5mg)と10mMピクリン酸を30分間反応させ、2％NaOHを加えてLys残基に結合したピクリン酸を吸光度で測定した（１）。次に皮膚感作性を有するシンナムアルデヒド、ハイドロキノン、オイゲノールとLysペプチドを含む樹脂を反応させた後、Lysペプチドと未反応のLys残基をピクリン酸で測定し（２）、吸光度の減少率（（２）／（１）＊100）を求めた。
シンナムアルデヒドおよびハイドロキノンをLysペプチドと反応させた後のピクリン酸の吸光度の減少率は5.9±22.8%、35.2±11.2%であった。また、オイゲノールと反応させた後のピクリン酸の吸光度は74.4±2.5%に減少したものの、シンナムアルデヒドやハイドロキノンのような減少率ではなかった。
従来の高速液体クロマトグラフィーを用いる、感作物質と結合したペプチドと未反応のペプチドを測定する方法とは異なり、本試験法は、96wellプレート上で感作性物質と未反応のLys残基をピクリン酸で定量できることが検証された。これらの情報を蓄積することにより、迅速かつ安価なアレルギー感作性試験代替法を提供することができると考えられる。 -
線維形成能および細胞毒性を有する短鎖ペプチド配列の予測・探索法の確立
2019年4月 - 2022年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
臼井 健二, 梅谷 智弘
線維形成能および細胞毒性を有する短鎖ペプチド配列の予測・探索法の確立
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金属錯体多面体を用いた外場応答型人工イオンチャネルの創製
2018年4月 - 2021年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
古川 修平, 臼井 健二, 坂口 怜子, 川野 竜司
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ペプチドと核酸の人工複合二次構造を用いた刺激応答感覚素子の作製
2015年4月 - 2017年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 新学術領域研究「感覚と知能を備えた分子ロボットの創成」
ペプチドと核酸の人工複合二次構造を用いた刺激応答感覚素子の作製
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アミロイドペプチドの凝集を規格化した細胞アッセイシステムの構築
2014年4月 - 2016年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 若手研究(B)
アミロイドペプチドの凝集を規格化した細胞アッセイシステムの構築
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動物由来の生細胞内におけるタンパク質間相互作用の定量的解析
2009年10月 - 2011年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 若手研究(スタートアップ)
相互作用に関与する２種のタンパク質の発現量を、ペプチド核酸導入ペプチドを用いることにより自在に変化させることで、動物由来の生細胞内でのタンパク質同士の相互作用を詳細かつ定量的に解析できる系の構築を目指した。具体的には、新規タンパク質発現制御システムの構築、自己相互作用をモデルにした細胞内外における相互作用検出系の構築、高効率解析を実現するための細胞アレイの構築の三点の基盤的事項の確立に成功した。
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細胞アレイを利用したアミロイド性ペプチドの設計・探索および機能解析
2008年4月 - 2009年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 特別研究員推奨費
本研究は、『生体内で機能を有するアミロイドペプチドを設計、合成、探索し、その生理的機能の解析や作用機序の解明を試みる』ことを目的としている。今年度は細胞アレイ構築への準備段階として、アミロイドβペプチド(Aβ)を題材にし、細胞内外におけるAβの局在とその構造状態も識別可能な融合タンパク質分子の創製を行った。まず設計では、Aβとの親和性と構造変化を見込むため、Aβの全配列や部分配列を用い、蛍光・発光変化には蛍光タンパク質EYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein)と発光タンパク質hRluc(humanized Renilla luciferase)をAβ配列両末端に配置した融合タンパク質を構築することにした。HeLa細胞にて目的タンパク質を発現させ、回収したライゼートにAβを加え、融合タンパク質の発光・蛍光を測定した。その結果、Aβを加えたサンプルでは、加えていないサンプルより、時間とともにhRluc由来の発光値が有意な差で大きく減少した。EYEP由来の蛍光値は、Aβの有無に関わらず時間が経過しても変化しなかった。以上より、蛍光によるAβの分布、発光によるモノマーの分布を解析することにより、Aβの凝集分布を解析できる系の確立が期待できる。また蛍光ペプチドを細胞に取り込ませて、死活性や、細胞への導入効果を共焦点顕微鏡で観察する実験も行い、ペプチドの配列によって、効果が異なることを見出している。以上の成果は現在、論文投稿へ向け執筆を行っている。本年度は細胞内におけるアミロイドペプチドの機能解析用アレイ構築への各種技術研究を行った。これらの研究は、ミスフォールディングが原因の疾病の解明・治療法の確立や、タンパク質構造変化に重点をおいたバイオナノ材料などへの展開など、医療・材料・学術分野に幅広く貢献できる。
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新規プロテインチップ開発を指向したデザインペプチドマイクロアレイの構築
2005年4月 - 2007年3月
学術振興機構 科学研究費助成事業 特別研究員推奨費
高性能プロテインチップの実現に向けて、ナノバイオ技術を用いたハイスループット検出が可能な設計ペプチドアレイの開発を行っている。平成17年度(前年度)は疎水性度や電荷などをペプチド高次構造を基本として体系的に変化させたペプチドライブラリの設計・合成を行い、これらを用いて、ナノリットルスケールでの標的タンパク質検出が可能であること示した。また、測定から得られたライブラリペプチドとタンパク質の結合パターンである、プロテインフィンガープリントから、タンパク質の物理化学的および機能的性質を解析するため統計学的手法を用いたデータ処理を行った。これらの結果を受けて平成18年度(今年度)は、特定のタンパク質群と結合する高次構造を有するペプチド群を体系的に多数配置したペプチドマイクロアレイを新たに作製し、それらタンパク質ネットワークを制御しうるペプチド性リガンドの迅速探索システム構築を行った。具体的には、生体内免疫系で重要な役割を担っているカルシニューリン-カルモジュリンシグナル伝達系を標的タンパク質ネットワークに設定し、ライブラリペプチドとカルモジュリンが相互作用することでカルシニューリンの脱リン酸化活性を制御できる機能性リガンドの獲得に成功しだ。また、これらリガンドペプチドの細胞における活性や毒性などをハイスループットに解析できるツールとして、非侵襲的な細胞アレイの開発にも取り組んだ。以上より、標的タンパク質に対する特異的リガンドを探索できるシステム、生体内における標的タンパク質・酵素などの発現・活性状況を解析できるシステムなど、ペプチドアレイの医療・環境分野への応用に向けた基盤研究が確立できた。今後、細胞を検体として、タンパク質群の発現状況の解析、細胞内で効果的に作用するリガンドの探索などの、より複雑かつ実用的な系への展開が期待できる。