講演・口頭発表等 - 本多 大輔
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Labyrinthula sp.で観察された複数の細胞が出入りするシスト様構造
樋口 里樹, 名久井 博之, 本多 大輔
第7回ラビリンチュラシンポジウム (福井県立大学 小浜キャンパス) 2022年12月
開催年月日： 2022年12月
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CARD-FISH法によるアプラノキトリウムの特異的染色法の開発
岩本 望，本多 大輔
第7回ラビリンチュラシンポジウム (福井県立大学 小浜キャンパス) 2022年12月
開催年月日： 2022年12月
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パリエティキトリウムの核融合の観察に向けた,核移行シグナルを付加した赤色蛍光タンパク質遺 伝子の 導入
瀬尾 貫太，木本 祐磨，馬詰 悠，本多 大輔
第7回ラビリンチュラシンポジウム (福井県立大学 小浜キャンパス) 2022年12月
開催年月日： 2022年12月
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ラビリンチュラ類の現存量推定にむけた定量PCR法の再検討
森本 冬海，本多 大輔
第7回ラビリンチュラシンポジウム (福井県立大学 小浜キャンパス) 2022年12月
開催年月日： 2022年12月
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ラビリンチュラ類パリエティキトリウム属株の核を標識する蛍光タンパク質遺伝子の導入
木元 佑磨, 馬詰 悠, 森本 冬海, 本多 大輔
日本藻類学会第46回大会 2022年3月
開催年月日： 2022年3月
ラビリンチュラ類の有性生殖に関しては，十分に明らかになっているとは言えない状況であるが，Parietichytrium属では，貧栄養状態になると有性生殖に関連する遺伝子の発現量の上昇と，遊走細胞の融合が観察された。さらに，この融合については株間において“＋”と“−”のような交配型の二極性に相当する現象が確認された。しかしながら，ラビリンチュラ類では外質ネットの細胞膜を共有して，近隣の細胞が連結することが頻繁に観察されるため，細胞の独立性は比較的低く，遊走細胞の融合が接合や受精に相当するかは結論づけられていない。そこで，核の融合が起こっているかを確認するため，Parieti¬chytrium属の“交配型”の異なる株のそれぞれに対して，核移行シグナル配列を付加した異なる色の蛍光タンパク質遺伝子を導入して，標識された核の挙動の観察を目指すことにした。まず，Parietichytrium属での恒常的な発現が予想されるプロモーター，核移行シグナル配列，蛍光タンパク質遺伝子，ユビキチン由来のターミネーターの各配列が並んだプラスミドの作製を行った。そして，このプラスミド由来の線状DNAをマルチパルスエレクトロポレーションで遺伝子導入を行った結果，蛍光をもつ形質転換体を獲得できた。今後は候補となる複数のプロモーターをついて，蛍光量から発現量の比較を行う予定である。
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パリエティキトリウム属株の細胞核の蛍光染色を目指したプラスミド作製
木元 佑磨, 森本 冬海, 馬詰 悠, 本多 大輔
第6回ラビリンチュラシンポジウム (広島大学・学士会館レセプションホール) 2021年12月
開催年月日： 2021年12月
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安定同位体脂肪酸を用いたアプラノキトリウム属株のDHA生合成経路の解析
山田 えり, 橋本 航太朗, 石橋 洋平, 伊東 信, 本多 大輔
第6回ラビリンチュラシンポジウム (広島大学・学士会館レセプションホール) 2021年12月
開催年月日： 2021年12月
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大阪湾におけるオブロンギキトリウム類の現存量の推定
森本 冬海, 浜本 洋子, 上田 真由美, 本多 大輔
第6回ラビリンチュラシンポジウム (広島大学・学士会館レセプションホール) 2021年12月
開催年月日： 2021年12月
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漁場環境を支える小さきもの：ラビリンチュラ — 魚類のDHAはどこからくるのか — 招待あり
本多 大輔
第181回海洋フォーラム「赤潮はどこまで解明されたか?―最新科学が明らかにする海の素顔―」 (リモート) 2021年5月 公益財団法人笹川平和財団海洋政策研究所
開催年月日： 2021年5月
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ラビリンチュラ類Aplanochytrium 属株が捕食する微細藻類の解明
宮岡 利樹,本多 大輔
日本藻類学会第45回東京大会 (東京（オンライン）) 日本藻類学会
開催年月日： 2021年3月
原生生物であるラビリンチュラ類は，世界中の海洋に生息し，環境中の有機物を分解吸収する分解者として認識されてきた。しかし最近，Aplanochytrium属株が生きている珪藻Skeletonema属株を捕食することが明らかとなり，生食連鎖の一部を担っていることが示唆された（Hamamoto & Honda, 2019, PloS ONE 14: e0208941）。そこで本研究では，Aplanochytrium属株と多様な微細藻類を二員培養することで，珪藻以外の微細藻類を捕食の対象としている可能性を調査し，その生態学的な役割の解明に向けた基礎情報を蓄積することを目的とした。その結果，シアノバクテリアについては捕食されている様子などは観察されなかったが，ハプト藻類および渦鞭毛藻類，緑藻類については捕食の対象とする可能性が示された。ただし，いずれもSkeleto¬nema属株との二員培養で観察されたほど，その捕食量や細胞の反応は顕著ではなかった。これらの微細藻類は外洋でも豊富に存在し，生態学的にも重要な一次生産者であると認識されており，ラビリンチュラ類が影響を及ぼす範囲について，改めて検討が必要なことを示している。
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環境DNAとしてのみ認知されるラビリンチュラ系統群の分離株確立への試み
石原 朋樹,森本 冬海,谷内 由貴子,奥西 将之,本多 大輔
日本藻類学会第45回東京大会 (東京（オンライン）) 日本藻類学会
開催年月日： 2021年3月
ラビリンチュラ類はストラメノパイルに属する葉緑体を持たない真核微生物である。海水，藻類やデトリタス，動物プランクトンの糞便ペレットなどの様々な基質から普遍的に分離されるため，海洋生態系において重要な生物として注目されている。しかし，これまでの環境DNAの網羅的解析で認識された主要群の中には，分離株の報告がなく，その学名はもちろん，形態を含む性状が全く不明の系統群が複数存在している。よって，生態学的役割の解明には，これらの未分離の主要系統群に位置するラビリンチュラ類について，他生物との捕食−被食関係や増殖特性などの情報を蓄積することが不可欠な状況となっている。そこで本研究では，沿岸や外洋域において環境DNAとしてのみ認知されている系統群の株を確立することを目指した。海水や泥, 動物プランクトンなどの採取物に対して，植物性や動物性の様々な釣り餌を使用し，抗生物質の入った寒天培地に塗布することで分離を行った。現時点では，目的とする未分離の系統群に位置する株の確立には至っていないが，AplanochytriumやUlkenia，Schizochytriumなどの系統群の株が分離できていることを確認した。
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マルチパルスエレクトロポレーション法を用いたParietichytrium sp.(ラビリンチュラ類)への遺伝子導 入の検討
馬詰 悠,石橋 洋平,伊東 信,早川 靖彦,本多 大輔
日本藻類学会第45回東京大会 (東京（オンライン）) 日本藻類学会
開催年月日： 2021年3月
ラビリンチュラ類Parietichytrium属は，鎖長伸長と不飽和化の酵素反応をくり返す多価不飽和脂肪酸を合成する経路を持っていることから，遺伝子破壊などによって，中間体となる脂肪酸の生成を制御し得るため注目されている。しかしながら，パーティクルガン法の適用が知られているだけであり，遺伝子導入の効率も低い状況となっている。そこで本研究では，エレクトロポレーション法を用いた，Parietichytrium sp. への遺伝子導入法を検討した。まずDNAの代わりにFITC-dextranを用いて，細胞内の蛍光を観察することで，物質の取り込みに適したパルスの電気条件を検討した。その結果，近縁種Aurantiochytrium属に適用されるエレクトロポレーション法と同程度の電圧条件に加え，物質を細胞内に送達するための低電圧を複数回与えるマルチパルスの優位性が確認された。しかしながら，この条件によるDNAを用いたエレクトロポレーションでは，形質転換体を得ることが出来なかった。そのため，これまで用いていたThraustochytrium属から得られたプロモーターではなく，Parieti¬chytrium属の複数のプロモーターを組み合わせてコンストラクトを設計し，このDNAを用いてマルチパルスエレクトロポレーション法による形質転換体の獲得について検討した。
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エレクトロポレーション法を用いた，Parietichytrium sp.（ラビリンチュラ類）への遺伝子導入の試み
馬詰 悠，石橋 洋平，伊東 信，早川 靖彦，本多 大輔
日本藻類学会第44回大会 (鹿児島大学) 日本藻類学会
開催年月日： 2020年3月
ラビリンチュラ類Aurantiochytrium属の多価不飽和脂肪酸（PUFAs）の代謝系は，ポリケチド様酵素複合体として機能していることから，代謝中間体の蓄積なしに，最終産物のドコサヘキサエン酸（DHA）が生成され，その生産性も高い。さらにエレクトロポレーション法やアグロバクテリウム法を用いて，高効率で遺伝子導入することが可能である。一方，Parietichytrium属は，鎖長伸長と不飽和化の酵素反応をくり返すことで，PUFAsを合成する経路を持っていることから，中間体となる脂肪酸の生成を制御することが可能とされるため注目されているが，遺伝子導入の成功例は非常に限られており，またパーティクルガン法の適用が知られているだけである。そこで本研究では，エレクトロポレーション法を用いた，Parietichytrium sp.の形質転換を試みた。まず，様々な電気条件について検討した。特に効果的と思われた，細胞膜に微細孔を開けるための高電圧電気パルス（Poring Pulse）を印加した後，遺伝子を細胞内に送り込むための低電圧電気パルス(Transfer Pulse)を複数回印加するパルス条件を試みた。しかしながら，形質転換体は得られていないため，電気条件に加え，電気パルスを印加する際の緩衝液の検討や，プロトプラスト化，細胞壁の薄い遊走細胞を用いることなどから，手法の確立を目指している。
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ラビリンチュラ類Aplanochytrium属株が栄養源とできる藻類の多様性
宮岡 利樹，茂木 大地，本多 大輔
日本藻類学会第44回大会 (鹿児島大学) 日本藻類学会
開催年月日： 2020年3月
原生生物ラビリンチュラ類は世界中の海洋に生息し，環境中の有機物を分解吸収する分解者として認識されてきた。しかし，Aplanochytrium属株が生きている珪藻Skeletonemaから栄養摂取を行うことが明らかとなり，生食連鎖の一部を担っていることが示唆された（Hamamoto & Honda, 2019, PloS ONE 14: e0208941）。そこで本研究では，Aplanochytrium属株と様々な微細藻類を二員培養することで，栄養源とできる微細藻類の多様性を明らかにすることを目的とした。その結果，珪藻類の複数の属株から栄養摂取することが観察され，さらに，ハプト藻類および渦鞭毛藻類，緑藻類からも栄養摂取する可能性が示された。珪藻類は地球上の一次生産の約20%を占めていると言われる重要な一次生産者であり，沿岸域に豊富に生息している。一方で，ハプト藻は外洋にも多く生息していることが知られている。渦鞭毛藻類や緑藻類も比較的現存量が大きく，生態的に重要なグループであることが広く知られている。以上のことから，ラビリンチュラ類Aplanochytrium属が栄養源とできる微細藻類の多様性が非常に高いため，その海洋生態系への影響は予想よりも大きく，また広い範囲に及ぶことが示唆された。
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DHAを蓄積する海洋真核生物ラビリンチュラ類の生態学的役割 招待あり
浜本洋子，庄野孝範，中井亮佑，上田真由美，長井敏，桑田晃，菊地淳，本多大輔
令和元年度漁場環境保全関係研究開発推進会議 赤潮・貝毒部会 (広島国際会議場) 国立研究開発法人 水産研究・教育機構 瀬戸内海区水産研究所
開催年月日： 2019年12月
【はじめに】
ラビリンチュラ類は，世界中の海洋に広く生息している従属栄養性の直径10 μm程度の単細胞真核生物である。これまで，セルラーゼなどの難分解性有機物に対する分解酵素を分泌すること，陸源有機物が豊富な河口域に多く生息することなどから，分解者として認識されてきた。沿岸域から外洋，熱帯から極域，表層から深海まで，あらゆる海洋環境中に分布していることが知られており，海生魚類が豊富に蓄積するが十分に生合成できないドコサヘキサエン酸（DHA）を細胞内に豊富に蓄積するため，その重要な供給源となっている可能性が示唆されながらも，ラビリンチュラ類の栄養源やその海洋生態学的な影響力については，明らかになっていなかった。
【Aplanochytrium属株の珪藻からの栄養摂取と凝集塊形成】
そこで，まず海洋の一次生産者として特に大きなバイオマスをもつ珪藻類を栄養源としている可能性について検討するため，系統的に多様なラビリンチュラ類と珪藻Skeletonemaとの二員培養を行った。その結果，Aplanochytrium属株は外質ネットで生きている珪藻に付着し，積極的に栄養摂取する様子が観察された。さらに緑藻類やハプト藻類も栄養源とできることも観察され，これまで認識されていなかった生食連鎖の経路が存在することが明らかとなった。また，栄養摂取の過程でAplanochytrium属株は藻類と凝集塊を形成し，動物プランクトンが捕食できる大きさとなり得ることが示唆された。実際に世界中の多くの海域を対象としたTARA Ocean projectの環境DNA調査において，20 μmよりも大きな粒子径からAplanochytrium系統群が検出され，食物網の中で効率よくエネルギーが転送されていると予想された（Hamamoto and Honda (2019) PLoS ONE 14(1): e0208941）。さらに，カイアシ類の消化管を対象としたNGSによる群集構造解析では，現場海水に比べ，顕著に多いAplanochytrium系統群の配列が観測され，選択的に捕食されている，あるいは共生などが起こっていることが示唆された（Hirai, Hamamoto et al. (2018) Plankton Benthos Res 13(2): 1–8）。
【現存量計測と群集構造解析による海洋生態系での影響力評価】
次にAplanochytrium系統群の現存量計測と群集構造解析から，ラビリンチュラ類全体が海洋生態系に与える影響力を評価した。大阪湾において，2017年5月から2018年4月までサンプリングをおこない，定量PCR法によって，細胞密度を測定した。その結果，1年間のAplanochytrium系統群の細胞密度の平均は湾央で2,100 cells/L，湾奥で13,000 cells/Lであった。また，群集構造解析を行った結果，ラビリンチュラ類全体のうち，Aplanochytrium系統群が湾央で77.1%（min 0.0～max 100.0%），湾奥で67.8%（min 0.0～max 100.0%）を占めることが明らかになった。これらの結果をもとに，ラビリンチュラ類の単位面積あたりの年間の炭素生産量を試算し，瀬戸内海で示されている炭素循環に適用して影響力を評価した。その結果，湾央と湾奥に生息するラビリンチュラ類は，真核生物に消費される植物プランクトンの炭素のうちそれぞれ6.1%，19.0%を消費し，微小動物プランクトンが消費する炭素のうち3.6％，16.2%，また，カイアシ類などの植物食性動物プランクトンでは1.8％，6.3%を供給していると推定された。これまでの報告から，カイアシ類が接餌した原生生物では，渦鞭毛藻類（約41%），繊毛虫類（約36%），珪藻（約15%），ナノ鞭毛藻類（約6%），その他の微細藻類（約3%）を占めるとされており（Yang et al., (2009) Journal of Plankton Research, 31(6): 647-659），ラビリンチュラ類は浮遊生態系を理解するうえで不可欠な生物群であるナノ鞭毛藻類と同程度の炭素をカイアシ類などに供給していることが示唆された。 -
STUDIES ON ECOLOGICAL ROLE AND EFFECT OF LABYRINTHULIDS IN MARINE ENVIRONMENT (LABYRINTHULEA, STRAMENOPILES)
Yoko Hamamoto, Takanori Shono, Ryosuke Nakai, Mayumi Ueda, Satoshi Nagai, and Daiske Honda
International Symposium on Aquatic Metagenomics 2019 (Kitasato University) International Symposium on Aquatic Metagenomics 2019 Secretariat
開催年月日： 2019年11月
Thraustochytrids inhabit the ocean all over the world and they have been recognized as important eukaryotic decomposers in the marine ecosystem. Our recent studies revealed a newly recognized pathway in the grazing food chain in the marine ecosystem for thraustochytrids, especially in Aplanochytrium. For example, Aplanochytrium strains obtain nutrients by consuming living diatoms (Hamamoto & Honda, 2019, PLoS ONE 14: e0208941). Also, Aplanochytrium is detected in the gut of zooplankton copepods, suggesting undetected predator–prey relationships in marine ecosystems (Hirai, Hamamoto et al., 2018, Plankton & Benthos Research, 13: 75–82). Here, we investigate their biomass to understand the ecological impact of Aplanochytrium and also thraustochytrids. First, we collected the environmental sample at Osaka Bay, Japan and cell number of Aplanochytrium in the seawater were estimated by quantitative PCR (qPCR) method. We next evaluated Illumina MiSeq-based metagenomic analyses using these samples. In these results, the number of the Aplanochytrium cells was estimated to be larger than in the previous quantitative methods and were particularly abundant among the taxa identified as thraustochytrids. Finally, we considered the carbon flow among major components of food web in Osaka Bay to assess the trophic roles of thraustochytrids. Based on the biomass of thraustochytrids, we evaluated the effect of thraustochytrids on phytoplankton and the effect on zooplankton. Compared with the previous studies on copepod diets (Yang et al., 2009, Journal of Plankton Research, 31: 647–659), it is speculated that thraustochytrids may also supply almost equal amount of the carbon to copepods which is known for nanoflagelates.
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Junya Hirai, Yoko Hamamoto, Daiske Honda, Kiyotaka Hidaka, Satoshi Nagai and Tadafumi Ichikawa
PICES 2019 Annual Meeting (The Annual Meeting will take place at the Victoria Conference Centre, Victoria, BC, Canada) The North Pacific Marine Science Organization (PICES)
開催年月日： 2019年10月
Successful feeding on preferred prey could be important for the survival of fish larvae. However, high taxonomic resolution of prey types from damaged gut contents is difficult to achieve through morphological classification, especially for fragile organisms or immature stages. Here, we applied 18S metabarcoding diet analysis to total 64 early post-larvae (< 10 mm) of Japanese sardine Sardinops melanostictus and Pacific round herring Etrumeus teres, which were collected from Tosa Bay (Japan) during their main spawning periods. There were no clear differences in the diets of the co-existing fish species, and copepods comprised the majority of the prey items. Among the copepods, the OTU derived from the large copepod Calanus sinicus was most consumed, followed by the OTU identified as small Paracalanus sp. Considering body size of copepods, the fish larvae actively consumed nauplii of C. sinicus, suggesting that both food availability and developmental stages of copepods determined prey preference. Additionally, we applied the same technique to 40 adult female C. sinicus. The majority of prey items were small crustaceans and diatoms, taxa that are dominant in the environment and have been previously reported as important prey items of Calanus. Aplanochytrids (Labyrinthulea) were detected for the first time as a major prey of C. sinicus, and high proportions of unclassified eukaryote material were also observed. These results suggest that further investigation into novel predator–prey relationships is recommended to understand the complex food web structures and population dynamics of commercially important fish species in marine ecosystems.
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海洋真核生物ラビリンチュラ類の生態学的役割と影響
浜本 洋子, 庄野 孝範, 中井 亮佑, 上田 真由美, 長井 敏, 本多 大輔
日本微生物生態学会第33回大会 (山梨大学) 日本微生物生態学会
開催年月日： 2019年9月
ラビリンチュラ類は，世界中の海洋に広く生息している従属栄養性の直径10 μm程度の単細胞真核生物である。これまで，セルラーゼなどの難分解性有機物に対する分解酵素を分泌することから，生態系における分解者として認識されてきた。しかし，我々の最近の研究によって，ラビリンチュラ類の1属であるAplanochytrium が生きている珪藻から栄養を摂取することを明らかとなり，未解明の生食連鎖の経路があることが予想された（Hamamoto and Honda (2019) PLoS ONE 14(1):e0208941）。そこで本研究では，Aplanochytrium に着目し，この現存量を計測することから，ラビリンチュラ類全体が海洋生態系に与える影響力を評価した。大阪湾において，2017年5月から2018年4月までサンプリングをおこない，A planochytrium の細胞密度を測定した。その結果，1年間のAplanochytrium の細胞密度の平均は湾央で2,100 cells/L，湾奥で13,000 cells/Lであった。また，次世代シーケンシング（NGS）を用いて1年間のラビリンチュラ類の群集構造解析を行った結果，ラビリンチュラ類全体のうち，Aplanochytrium が湾央で77.1%（min 0.0 ～ max 100.0%），湾奥で67.8%（min 0.0 ～ max 100.0%）を占めることが明らかになった。さらに，ラビリンチュラ類の単位面積あたりの年間の炭素生産量を試算し，瀬戸内海で示されている炭素循環に適用して影響力を評価した。その結果，湾央と湾奥に生息するラビリンチュラ類は，真核生物に消費される植物プランクトンの炭素のうちそれぞれ6.1%，19.0%を消費し，微小動物プランクトンが消費する炭素のうち3.6％，16.2%，また，植物食性動物プランクトンでは1.8％，6.3%を供給していると推定された。カイアシ類の食性解析では，カイアシ類は接餌した原生生物のうち，渦鞭毛藻類（約41%），繊毛虫類（約36%），珪藻（約15%），ナノ鞭毛藻類（約6%），その他の微細藻類（約3%）を占めることが報告されている（Yang et al., (2009) Journal of Plankton Research, 31(6), 647-659）。以上のことから，ラビリンチュラ類は，浮遊生態系を理解するうえで不可欠な生物群であるナノ鞭毛藻類などと同程度の炭素を供給していることが示唆された。
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Distribution of a novel sphingolipid, ceramide glyoxylic ethanolamine (CGE), in thraustochytrids
Minato Kasari, Natsumi Hasegawa, Yohei Ishibashi, Tomofumi Miyamoto, Masahiro Hayashi, Daiske Honda, Nozomu Okino, and Makoto Ito
First International Conference on Labyrinthulean Protists (Konan University) ICoLP 2019 Secretariat
開催年月日： 2019年8月
Sphingolipids, a class of lipids containing a sphingoid base, are ubiquitous cellular membrane components of all eukaryotes and some prokaryotes. Since thraustochytrids have the characteristic of producing large quantities of DHA-containing glycerolipids, special attention has been paid to glycerolipids and their metabolism so far. However, the composition and metabolism of sphingolipids are largely unknown in thraustochytrids. In this study, we analyzed the sphingolipid profile of different genera of thraustochytrids, Aurantiochytrium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium and Parietichytrium with LC-ESI MS/MS. Sphingolipid profile of Thraustochytrium is completely different from that of Aurantiochytrium; that is, the former possesses ceramide phosphoethanolamine (CPE), a phosphosphingolipid composed of a ceramide and phosphoethanolamine, as a major complex sphingolipid, while the latter does not contain known sphingolipids such as CPE or glycosphingolipids. Instead, Aurantiochytrium possesses a novel sphingolipid showing unkown fragmentation pattern in MS/MS analysis. NMR and high-resolution mass spectrometry analyses revealed that the novel sphingolipid, tentatively designated as Ceramide Glyoxylic Ethanolamine (CGE), has a novel head group containing amino and carboxyl groups, which is bound to ceramide via acetal structure. CGE is distributed in not only Aurantiochytrium, but also in Thraustochytrium, Schizochytrium, and Aplanochytrium, although the content is quite different depending on the genera. At present, CGE has not been found in mammals, fishes, algae, and other stramenopiles except thraustochytrids, suggesting that CGE is the thraustochytrid-specific sphingolipid.
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Yoko Hamamoto, Takanori Shono, Ryosuke Nakai, Mayumi Ueda, Satoshi Nagai, and Daiske Honda
First International Conference on Labyrinthulean Protists (Konan University) ICoLP 2019 Secretariat
開催年月日： 2019年8月
Thraustochytrids inhabit the ocean all over the world and they have been recognized as important eukaryotic decomposers in the marine ecosystem. Our recent studies revealed a newly recognized pathway in the grazing food chain in the marine ecosystem for thraustochytrids, especially in Aplanochytrium. For example, Aplanochytrium strains obtain nutrients by consuming living diatoms (Hamamoto & Honda, 2019, PLoS ONE 14: e0208941). Also, Aplanochytrium is detected in the gut of zooplankton copepods, suggesting undetected predator–prey relationships in marine ecosystems (Hirai, Hamamoto et al., 2018, Plankton & Benthos Research, 13: 75–82). Here, we investigate their biomass to understand the ecological impact of Aplanochytrium and also thraustochytrids. First, we collected the environmental sample at Osaka Bay, Japan and cell number of Aplanochytrium in the seawater were estimated by quantitative PCR (qPCR) method. The averages of cell number were 2,100 cells l-1and 13,000 cells l-1 in the inner and middle part of Osaka Bay respectively. We next evaluated Illumina MiSeq-based metagenomic analyses using these samples. In this result, Aplanochytrium were particularly abundant among the taxa identified as thraustochytrids, accounting at the inner and middle part of Osaka Bay, 77.1% (min. 0.0, max. 100.0%) and 67.8% (min. 0.0, max. 100.0%) respectively. Finally, we considered the carbon flow among major components of food web in Osaka Bay to assess the trophic roles of thraustochytrids. Based on the biomass of thraustochytrids, it was estimated thraustochytrids graze 6.1% and 19.0% of the carbon produced by phytoplankton which is consumed by the predator, on the other hand, they also supply 3.6% and 16.2% of the carbon consumed by the microzooplankton (e.g., ciliates) and 1.8% and 6.3% of the carbon consumed by the herbivorous net-zooplankton (e.g., copepods) in the inner and middle part respectively. The previous studies on copepod diets showed that the copepods consumed heterotrophic dinoflagellates (41%), ciliates (36%), diatoms (15%), nanoflagellates (6%), other microalgae (3%) (Yang et al., 2009, Journal of Plankton Research, 31: 647–659). From these results, we speculate that thraustochytrids may also supply almost equal amount of the carbon to copepods which is known for nanoflagelates.