Papers - ENDOH Tamaki
-
Suppression of gene expression by G-quadruplexes in open reading frames depends on g-quadruplex stability Reviewed
Endoh T, Kawasaki Y, Sugimoto N
Angew. Chem. Int. Ed. 52 5522 - 5526 2013.5
-
Selection of RNAs for constructing “Lighting-UP” biomolecular switches in response to specific small molecules Reviewed
Endoh T, Sugimoto N
PLoS ONE 8 e60222 2013.3
Joint Work
Authorship:Lead author
生体内では、様々な分子が、分子間のアロステリックな相互作用を介して機能発現を調節している。例えば、リボスイッチと呼ばれる機能性RNAは、特定の代謝産物に応答して遺伝子の発現を調節する。特に、翻訳反応の調節に関わるリボスイッチの場合、mRNA上に存在するリボスイッチが構造変化することで、リボソームとmRNAとの相互作用がアロステリックに制御されている。このようなメカニズムは、RNAと特定分子との結合に伴うRNAの構造変化が、タンパク質機能の調節に有用であることを示している。
本研究では、特定の低分子化合物を検出するために、RNA‒タンパク質間のアロステリック相互作用を利用した発光バイオセンサーを構築した。我々はこれまでに、RNAの検出を目的とした遺伝子改変型のルシフェラーゼを構築しており、特定のRNAとの結合を発光シグナルで検出することに成功している。そこで、低分子化合物との結合によるRNA構造変化を起因とし、改変型ルシフェラーゼと結合できるようになるRNAを構築することにした。喘息薬の一種であるテオフィリン、および抗生物質の一種であるテトラサイクリンを検出対象とし、これらの分子に特異的に結合することが知られるRNAアプタマーを利用した。それぞれのRNAアプタマーと、改変型ルシフェラーゼとの結合に必要なTAR-RNAとをランダムな配列を介して連結したRNAライブラリーを設計した。そして、テオフィリン、テトラサイクリンに応答して、TAR-RNAの結合標的であるTatペプチドと相互作用するRNAをセレクションにより獲得した。6サイクルのセレクション過程を経たのちに得られたRNAは、それぞれの標的分子に応答してTatペプチドとの結合定数が10倍以上上昇した。そこで、生体外翻訳系を用いて発現させた改変型ルシフェラーゼと、セレクションにより得られたRNAとを混合し、発光シグナルによる標的分子の検出を試みた。その結果、標的分子の濃度に依存した発光シグナルの上昇が確認でき、テオフィリン10 μM、テトラサイクリン2 μMでも有意に検出可能であった。このことは、RNAによる分子認識と、それに引き続くタンパク質とのアロステリックな相互作用を介して、ルシフェラーゼの発光反応触媒機能を調節できたことを示している。RNAとタンパク質はどちらも細胞内で発現させることが可能であり、細胞内で機能する発光バイオセンサーへの応用が期待される。 -
Dehydration from conserved stem regions is fundamental for ligand-dependent conformational transition of the adenine-specific riboswitch Invited Reviewed
Kumar V, Endoh T, Murakami K, Sugimoto N
Chem. Commun. 48 9693 - 9695 2012.9
Joint Work
DOI: 10.1039/C2CC34506D
-
Synchronized translation for detection of temporal stalling of ribosome during single-turnover translation Reviewed
Endoh T, Kawasaki Y, Sugimoto N
Anal. Chem. 84 857 - 861 2012.1
Joint Work
Authorship:Lead author
翻訳伸長反応は一律に進むのではなく、様々な因子の影響を受け、その速度が大きく変化する。特に、mRNA中に存在するレアコドンや安定な二次構造は、翻訳伸長反応速度を低減させることが知られている。近年、翻訳伸長反応の一時的な停滞や速度変化が、タンパク質の構造形成過程に大きな影響をもたらすことが明らかになりつつある。つまりmRNAは、ただ単にアミノ酸配列を規定するだけではなく、翻訳伸長反応速度への影響を介して、タンパク質の機能発現までも調節している可能性がある。そのため、mRNA上のどの位置で、どの程度、翻訳伸長反応が停滞したり速度変化を示したりするのかを正確に解析することが重要である。しかしながら、翻訳反応過程では、律速となる反応が翻訳開始過程にあることが知られており、翻訳伸長反応のみに焦点を当てた解析は、既存の解析手法では困難である。
本研究では、翻訳伸長反応のみに焦点を当て、反応過程の継時的な解析を可能にするSynchronized Translation(同調翻訳)という解析手法を構築した。一段階目の反応として、再構成型の無細胞翻訳反応系を利用し、翻訳反応溶液から特定のアミノアシルtRNA合成酵素を取り除いておくことで、翻訳を開始したリボソームを特定のコドンの位置で強制的に停止させた。また、この反応段階において非天然蛍光アミノ酸を翻訳産物に導入し、翻訳産物を蛍光シグナルで解析できるようにした。二段階目の反応として、翻訳反応に必要な全ての因子を含む反応溶液を加え、翻訳伸長反応を一段階目で停止させてある位置から再開させた。これにより、律速段階となる翻訳開始過程を省き、1分間というこれまでにはない短い時間軸における経時的な翻訳伸長反応の解析を可能にした。結果として、46アミノ酸を伸長する間に3カ所で翻訳伸長反応が一時的に停滞し、そのうちの2カ所はレアコドンが原因となっていることが明らかとなった。DOI: 10.1021/ac202712g
-
Photosensitizing carrier proteins for photoinducible RNA interference Reviewed
Matsushita-Ishiodori Y, Kuwabara R, Sakakoshi H, Endoh T, Ohtsuki T
Bioconjug. Chem. 22 2222 - 2226 2011.10
Joint Work
-
Direct detection of RNAs in living cells using peptide-inserted Renilla luciferase Reviewed
Andou T, Endoh T, Mie M, Kobatake E.
Analyst 136 2446 - 2449 2011.5
Joint Work
-
Gene regulation system with an artificial RNA switch operating in human cells Reviewed
Endoh T, Sugimoto N.
Chembiochem. 2011 Apr 29. [Epub ahead of print] 2011.4
Joint Work
Authorship:Lead author
近年、リボスイッチと呼ばれる機能性RNAを利用した特徴的な遺伝子発現制御機構の存在が明らかになってきている。リボスイッチは主に、mRNAの5’非翻訳領域中に存在しており、標的となる代謝産物の結合に伴うRNAの構造変化を介して遺伝子発現を調節している。これまで、原核生物では多種類のリボスイッチが確認されているものの、真核生物ではごく少数の生物種に限られており、特にヒトを中心とした高等生物では報告例がない。一方で、リボスイッチに類似した機構による人工的な遺伝子発現制御システム(人工リボスイッチ)がいくつか開発されているものの、これまでのところ転写後反応の制御に機能する人工リボスイッチに関する報告のみであった。
本研究では、特異的なRNA配列(TAR-RNA)に結合して遺伝子の転写を活性化する免疫不全ウイルス由来のトランス活性化因子(Tat)を利用し、ヒト細胞内での遺伝子発現を転写段階で制御できる人工リボスイッチシステムの構築を行った。TAR-RNAのループ部位に対して、低分子化合物(テオフィリン)に結合するRNAアプタマーを挿入した人工RNAを設計し、これをもとにレポーターベクターを構築した。そして、作製したベクターを、Tatを発現するベクターと共にHeLa細胞に導入し、テオフィリン存在下での遺伝子発現を評価した。その結果、0 – 1 mMの範囲において、培地中に添加したテオフィリン濃度に依存して遺伝子発現が抑制されることが示された。細胞外の実験結果から、テオフィリン存在下において設計したRNAとTatとの結合定数が減少することが示されているため、TAR-RNAに挿入したアプタマーとテオフィリンとの結合がTatの結合および転写の活性化を阻害していると考えられる。 -
Development of an RNA detection system using bioluminescence resonance energy transfer Reviewed
Andou T, Endoh T, Mie M, Kobatake E
Sensor Actuat. B Chem. 152 ( 2 ) 277 - 284 2011.3
Joint Work
-
Evaluation of small ligand-protein interactions by using T7 RNA polymerase with DNA-modified ligand Reviewed
Mie M, Sugita R, Endoh T, Kobatake E.
Anal. Biochem. 405 ( 1 ) 109 - 113 2010.6
Joint Work
-
Cellular siRNA delivery using TatU1A and photo-induced RNA interference Invited
Endoh T, Ohtsuki T
Methods Mol. Biol. 623 271 - 281 2010.4
Joint Work
Authorship:Lead author
-
Improvement of CPP-RBD for siRNA Delivery
Kuwabara Rina, Endoh Tamaki, Sisido Masahiko, Ohtsuki Takashi
ANIMAL CELL TECHNOLOGY: BASICS & APPLIED ASPECTS 16 191 - 196 2010
-
Detection of bioactive small molecules by fluorescent resonance energy transfer (FRET) in RNA-protein conjugates Reviewed
Endoh T, Shintani R, Mie M, Kobatake E, Ohtsuki T, Sisido M.
Bioconjug. Chem. 20 2242 - 2246 2009.12
Joint Work
Authorship:Lead author
-
PNA Arrays for miRNA Detection Reviewed
Endoh T, Kitamatsu M, Sisido M, Ohtsuki T
Chem. Let. 38 438 - 439 2009.5
Joint Work
Authorship:Lead author
-
Carrier PNA for shRNA delivery into cells Reviewed
Kitamatsu M, Kubo T, Matsuzaki R, Endoh T, Ohtsuki T, Sisido M
Bioorg. Med. Chem. Lett. 19 3410 - 3413 2009.5
Joint Work
-
Spatial regulation of specific gene expression through photoactivation of RNAi Reviewed
Endoh T, Sisido M, Ohtsuki T
J. Control. Release 137 241 - 245 2009.4
Joint Work
Authorship:Lead author
-
APPLICATIONS OF PEPTIDE NUCLEIC ACIDS FOR RNA PURIFICATION, RNA DETECTION, AND INTRACELLULAR RNA DELIVERY
Takashi Ohtsuki, Tamaki Endoh, Mizuki Kitamatsu, Masahiko Sisido
IFPT'6: PROGRESS ON POST-GENOME TECHNOLOGIES, PROCEEDINGS 22 - 23 2009
Joint Work
Publisher:SOUTHEAST UNIV PRESS
Peptide nucleic acids (PNAs) are nucleic acid analogs with an achiral polyamide backbone. Since the PNA-RNA hybrids are thermally more stable than the corresponding DNA-RNA or RNA-RNA hybrids, PNAs can be tools for catching and detecting RNAs. In this study, we developed PNA-based methods for RNA isolation, RNA detection, and intracellular RNA delivery.
-
Direct detection of RNA transcription by FRET imaging using fluorescent protein probe Reviewed
Endoh T, Mie M, Kobatake E
J. Biotechnol., 133 413 - 417 2008.11
Joint Work
Authorship:Lead author
-
RNA detection using peptide-inserted Renilla luciferase Reviewed
Andou T, Endoh T, Mie M, Kobatake E
Anal. Bioanal. Chem. 393 661 - 668 2008.11
Joint Work
-
Cellular siRNA delivery mediated by a cell-permeant RNA-Binding protein and photoinduced RNA interference Reviewed
Endoh Tamaki, Sisido Masahiko, Ohtsuki Takashi
BIOCONJUGATE CHEMISTRY 19 ( 5 ) 1017 - 1024 2008.5
-
Cellular siRNA delivery mediated by cell-penetrating RNA-binding protein and photo-induced RNA interference Reviewed
Endoh T, Sisido M, Ohtsuki T
Bioconjug. Chem., 19 1017 - 1024 2008.4
Joint Work
Authorship:Lead author